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甲烷是主要的溫室氣體成分，其產(chǎn)生的增溫潛勢比二氧化碳高25倍，甲烷對全球氣候變暖的貢獻率達15％～20％。據(jù)報道，大氣中動物甲烷的排放量約為8.0×10⁷ｔ，反芻動物甲烷的排放量約占全球總量的15％，其中牛每年甲烷的排放量約占畜禽甲烷總產(chǎn)量的73％。反芻動物排放的甲烷，不僅帶來了嚴重的環(huán)境壓力，同時也引起了6％～15％的飼料能量損失。因此，利用營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)減少反芻動物甲烷排放對于保護環(huán)境和提高飼料能量利用率具有雙重意義。

多年來，降低甲烷排放、提高飼料轉(zhuǎn)化率一直是反芻動物營養(yǎng)工作者的研究重點。降低瘤胃中甲烷產(chǎn)量主要通過兩條途徑：一是抑制甲烷菌的數(shù)量，降低甲烷的產(chǎn)量，如添加硫酸鹽、亞硝酸鹽，促進硫酸鹽、亞硝酸鹽還原菌在瘤胃內(nèi)的生長，使其與甲烷生成菌競爭氫，以抑制甲烷菌的生長，從而減少甲烷產(chǎn)生和排放，但是瘤胃中硝酸鹽過量時，極易引起亞硝酸鹽中毒，從而降低反芻動物的采食量；二是營養(yǎng)調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式，使其從乙酸發(fā)酵型轉(zhuǎn)變?yōu)楸纾海保┠芫氐入x子型載體，能夠改變瘤胃發(fā)酵類型使瘤胃微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)為丙酸發(fā)酵為主，抑制甲烷、二氧化碳等氣體的產(chǎn)生，但是長期、大量使用會造成動物生產(chǎn)性能下降、飼料轉(zhuǎn)化率降低，甚至產(chǎn)生毒害作用；２）絲蘭提取物、皂素等植物提取物也可促進瘤胃微生物向丙酸發(fā)酵轉(zhuǎn)變，有效抑制瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)量，但植物提取物種類繁多，作用機制不盡相同，多為短期效應。

精氨酸（Arg）作為功能性氨基酸之一，可以改善N代謝、血管生成和促進生長發(fā)育，參與脂肪代謝，增強免疫功能。目前，動物體內(nèi)精氨酸的需要量往往被低估，但精氨酸在瘤胃中極易被降解，直接飼喂效果差，此外，精氨酸價格昂貴，而瘤胃保護型精氨酸經(jīng)濟效益不合算。Ｎ-氨甲酰谷氨酸（NCG）是Ｎ-乙酰谷氨酸（NAG）輔因子的結(jié)構(gòu)類似物，其瘤胃降解率較低，能促進內(nèi)源精氨酸的生成，是精氨酸的潛在代替物。NCG可以使機體維持較高的精氨酸水平，同時又避免與賴氨酸等堿性氨基酸形成拮酸發(fā)酵型，減少H₂的產(chǎn)生，從而降低甲烷產(chǎn)量，促進機體氨基酸平衡。氨基酸能夠通過轉(zhuǎn)氨基作用脫去氨基生成α-酮戊二酸和氨，前者氧化脫羧形成琥珀酰CoA，進入三羧酸循環(huán)，進而增加琥珀酸等有機酸的產(chǎn)量，從而促進丙酸生成，終影響甲烷的排放量。國內(nèi)外關(guān)于NCG對肉牛生產(chǎn)性能、甲烷排放量的影響研究較少，本試驗旨在研究添加不同劑量的 NCG對荷斯坦奶公牛生長性能、瘤胃發(fā)酵和微生物區(qū)系以及甲烷排放量的影響，為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

試驗于2018年９-12月在保定市滿城宏達牧業(yè)有限公司進行，正試期90d，預試期7ｄ。

Ｎ-氨甲酰谷氨酸（NCG）購于亞太興牧科技有限公司。

本試驗采用完全隨機分組試驗設(shè)計，選擇體重（478±13.66）kg左右、健康、膘情正常的荷斯坦奶公牛45頭，隨機分成3組，每組15個重復，每個重復１頭牛，散欄飼養(yǎng)。各組飼喂相同的日糧，Ⅰ（對照組）、Ⅱ、Ⅲ組每頭公牛分別投喂0、15、25ｇ/d的NCG，試驗各組蛋白與能量水平一致，試驗日糧組成及營養(yǎng)成分見表１。

試驗用奶公牛采用全混合日糧（TMR）飼喂，飼養(yǎng)管理一致。每天飼喂兩次，自由飲水，定期消毒，每天打掃料槽，每周清洗水槽２～３次，保持水槽和料槽干凈、衛(wèi)生。為奶公牛提供潔凈的水源和干凈的休息場地。

1、滲透管的制作與選擇

（1）準備好液氮罐、扳子、滲透管、冰袋、六氟化硫氣體、鋼網(wǎng)、聚四氟乙烯膜、線手套等。將組裝好的滲透管稱重，重量記錄為W₁。

（2）將稱好的滲透管放入液氮中，待管體溫度和液氮溫度一樣時，取出滲透管并迅速充入SF₆純氣體，當管壁結(jié)晶不再增多時，迅速將管帽封閉嚴實，室溫下稱重記錄為W₂。氣體重量（W₂-W₁）＞1ｇ，即為合格的滲透管。

（3）將合格的SF₆滲透管投放入已準備好的恒溫水浴箱中，溫度設(shè)為39℃，通入40ｍＬ/min流量的氮氣。

（4）每隔3ｄ稱重，記錄好滲透管的重量。

（5）統(tǒng)計好60ｄ所有滲透管數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。根據(jù)本試驗的投放時間和在瘤胃內(nèi)釋放的天數(shù)終選出12個滲透管，于采樣前20ｄ投入采樣牛的瘤胃中。預計試驗結(jié)束時管內(nèi)SF₆剩余量＞300ｍg，SF₆的滲透速率＞2.8ｍg/d。12個滲透管的數(shù)據(jù)見表２。

試驗結(jié)束時管內(nèi)剩余SF₆重量（mg）＝ 滲透管投放時SF₆的重量（mg）-SF₆的滲透速率（mg/d）＊滲透管投放天數(shù)（ｄ）。

2、牛軛及氣體收集裝置的制作牛軛主要是根據(jù)荷斯坦奶公牛的大小，由三型聚丙烯管經(jīng)過截取，之后用熱熔機連接。然后將二通閥固定到牛軛上，后要保證牛軛的氣密性。試驗前檢查每個集氣裝置的氣密性。牛軛及牛龍頭為本實驗室制作，其他零件購于美國Swagelok公司。

分別在試驗前和試驗末期晨飼前，試驗?？崭狗Q重，用于計算平均日增重（ADG）；在試驗期間每15ｄ連續(xù)3ｄ測定其采食量，采集鮮料、剩料于105℃烘４h，待冷卻至室溫稱重，計算干物質(zhì)采食量（DMI）；飼料轉(zhuǎn)化效率（F/G）等于平均日干物質(zhì)采食量除以平均日增重。

試驗末期，每組隨機選?。殿^試驗牛，采用口腔采樣法，采集試驗牛瘤胃液，每頭牛抽取約200ｍＬ瘤胃液，其中10ｍＬ分裝至無菌離心管中，用于測定瘤胃微生物區(qū)系，-80℃保存；余下瘤胃液用４層無菌棉紗布過濾后收集濾液，分裝于10ｍＬ離心管中，用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)的評定。瘤胃液ｐＨ使用酸度計現(xiàn)場測定，氨態(tài)氮（NH₃-Ｎ）（加入0.1mL ６ mol·L^-1鹽酸固氮）、微生物蛋白（MCP）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）需當天前處理，將處理好的樣品于-20℃保存。

采用SF₆示蹤氣體色譜法測定反芻動物甲烷排放量。試驗結(jié)束前20d，每組隨機選取４頭食欲良好、健康的荷斯坦奶公牛，將已知SF₆釋放速率的滲透管投放至選出牛的瘤胃中。試驗結(jié)束前3d采集氣體樣。記錄每次打開牛扼和關(guān)閉牛扼結(jié)束采樣的時間，期間有值班人員，檢查集氣設(shè)備是否完好，及時更換牛軛。同時，每天于距地面50cm處收集一管牛舍周圍環(huán)境的氣體樣品做空白，從而矯正甲烷和SF₆的濃度。

式中：R_CH4是甲烷排放速率，單位L·d^-1；R_SF6是SF₆的滲透速率，單位mg·d^-1；6.518是SF₆的密度，單位kg·m^-3；［CH₄］是樣品氣中甲烷的濃度，10^-6（摩爾分數(shù)）；［SF₆］是樣品氣中SF₆的濃度，10^-12（摩爾分數(shù)）。

采用SAS9.4軟件的MIXED模型進行分析，Y_ij＝μ＋G_i＋e_ij，其中Y_ij是要測試的指標，μ是平均值，G_i是NCG添加水平的固定效應（ｉ＝0、15或 25ｇ·d^-1），e_i是殘差。微生物菌群的相對豐度參照 Cobellis等的方法進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，以提高正態(tài)分布。用PDIFF 矯正的Yukey模型進行多重比較。Ｐ＜0.05表示差異顯著，Ｐ＜0.1表示有差異顯著趨勢。試驗結(jié)果以平均值表示。

由表３可知，日糧中添加不同水平NCG對荷斯坦奶公牛的試驗末重及日增重無顯著差異（Ｐ＞0.05）；干物質(zhì)采食量呈線性下降（Ｐ＜0.05），Ⅲ組顯著低于Ⅰ組（Ｐ＜0.05），與Ⅱ組差異不顯著；與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組的飼料轉(zhuǎn)化效率分別改善了6.91％和7.91％（Ｐ＜0.05）。

由表４可知，不同試驗組瘤胃液pH、NH₃-N和乙酸濃度差異不顯著（Ｐ＞0.05）。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組MCP濃度提高了22.91％和15.17％（Ｐ＜0.01）；Ⅱ、Ⅲ組丙酸濃度顯著高于對照組（Ｐ＜0.01）；Ⅱ組總揮發(fā)性脂肪酸濃度顯著高于Ⅰ組（Ｐ＜0.05）。

由表５可知，各試驗組，瘤胃古菌的覆蓋度都超過99％，說明測序深度高，足以反映古菌菌群的多樣性及豐富度。瘤胃古菌中香濃指數(shù)、辛普森指數(shù)三組之間沒有顯著性差異（Ｐ＞0.05）。Ⅲ組Chaol指數(shù)與ACE指數(shù)顯著低于Ⅰ組與Ⅱ組（Ｐ＜0.01），且線性降低（Ｐ＜0.01），說明隨著NCG添加量的增加，瘤胃中產(chǎn)甲烷古菌群落的豐富度逐漸下降。

由表７可以看出，隨著NCG添加量的增多甲烷排放量線性降低（Ｐ＜0.01）。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組甲烷排放量分別降低了8.44％和10.51％（Ｐ＜0.01）。

精氨酸是一種功能性氨基酸，作為多胺和一氧化氮的前體物，在多個生理反應、代謝調(diào)控中起著重要作用。精氨酸能夠促進動物體的尿素循環(huán)，其代謝產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán)，提高Ｄ-葡萄糖-６-磷酸含量，加速糖酵解溶液途徑的新陳代謝，從而提高能量的利用效率，能量充足進而動物采食量降低。NCG是精氨酸的潛在代替物，能夠促進內(nèi)源精氨酸的生成，并保持體內(nèi)較高的精氨酸水平。本試驗結(jié)果表明，添加NCG線性降低奶公牛的采食量，當添加量15ｇ· d^-1時能改善奶公牛的飼料轉(zhuǎn)化效率，說明添加15ｇ· d^-1NCG有可能通過增加奶公牛內(nèi)源精氨酸的生成，有利于機體中脂肪酸和葡萄糖的氧化，提高細胞能量利用效率，進而降低動物采食量。與黃雅莉等在三黃雞添加0.4％與0.5％的NCG的研究結(jié)果一致。

反芻動物瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標，在維持瘤胃內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定中起主導作用。瘤胃pH處于5.5～7.5時為正常范圍。本試驗中，荷斯坦奶公牛瘤胃液pH均處于正常范圍，添加NCG不會影響奶公牛瘤胃正常發(fā)酵。飼糧中的蛋白質(zhì)、非蛋白氮和機體內(nèi)源氮在瘤胃中降解產(chǎn)生的NH₃-N是瘤胃微生物代謝過程中的主要氮源，同時也是合成MCP的原料。瘤胃中MCP含量能夠反映瘤胃微生物對蛋白質(zhì)的利用程度，其合成效率與NH₃-N濃度密切相關(guān)。Oba等的研究表明，補充NCG能夠促進尿素循環(huán)，提高瘤胃和十二指腸中NH₃-N的利用，為微生物蛋白的合成提供了更多的氮源。本試驗結(jié)果顯示，添加NCG對NH₃-N的濃度有降低趨勢，顯著增加了瘤胃微生物蛋白的含量，原因是NCG能夠避免瘤胃中氨態(tài)氮降解造成的氮損失，使瘤胃微生物合成更多的MCP，這與劉建新的研究結(jié)果一致。

VFA是飼糧中碳水化合物發(fā)酵的終產(chǎn)物，可為反芻動物提供能量。其中乙酸、丙酸和丁酸共占總VFA的95％。NCG能促進瓜氨酸的生成，瓜氨酸在一系列酶的作用下將精氨酸代琥珀酸分解為精氨酸和延胡索酸，從而增加了延胡索酸的生成量。研究表明，延胡索酸能夠增加纖維分解菌的多樣性及數(shù)量，提高纖維分解酶活性、瘤胃中丙酸及總揮發(fā)性脂肪酸的濃度。本試驗每頭動物添加 15ｇ· d^-1NCG，增加了乙酸濃度，顯著提高了丙酸濃度。丙酸含量增多，減少了瘤胃內(nèi)Ｈ₂，從而減少瘤胃中甲烷的生成。

反芻動物甲烷主要產(chǎn)生部位是瘤胃，原因是瘤胃中存在產(chǎn)甲烷古細菌。產(chǎn)甲烷菌是瘤胃中主要的耗氫微生物，隸屬于廣古菌門，合成途徑主要有以下３種：一是氫營養(yǎng)型，以氫和二氧化碳為底物，可生成80％ 的甲烷；二是VFA裂解，由甲酸生成18％的甲烷，由乙酸生成３％～５％的甲烷；三是甲基化合物合成，甲烷產(chǎn)生量少。目前，廣泛存在于反芻動物瘤胃內(nèi)的４個產(chǎn)甲烷菌屬有甲烷桿菌屬、甲烷短桿菌屬、甲烷微菌屬和甲烷八疊球菌屬。給奶牛飼喂月桂酸后甲烷短桿菌的含量占總古菌的70％，而當飼喂肉蔻酸及硬脂酸，甲烷短桿菌的含量達到92％。本試驗中，甲烷短桿菌為優(yōu)勢菌群，其次為甲烷球菌屬。添加NCG后，甲烷短桿菌的相對豐度有所降低，甲烷球菌屬顯著降低。原因是添加NCG的荷斯坦奶公牛瘤胃中丙酸利用菌與產(chǎn)甲烷菌競爭氫氣產(chǎn)生丙酸，減少了甲烷菌形成的底物，從而降低了甲烷短桿菌的相對豐度，降低了甲烷的產(chǎn)量。Danielsson 等研究表明，甲烷短桿菌的群落結(jié)構(gòu)也與腸道甲烷排放有關(guān)。對瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的作用機制尚需進一步研究。

甲烷是瘤胃中有機物質(zhì)發(fā)酵的產(chǎn)物之一，減少甲烷排放量對保護環(huán)境及提高飼料利用率具有雙重意義。反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生不僅與產(chǎn)甲烷菌有關(guān)，同時飼養(yǎng)水平、采食量等都會影響其甲烷的產(chǎn)量。飼料中加入晶體氨基酸能夠提高飼料效率和能量保留率。郭添福研究表明，飼料中添加氨基酸時能夠降低畜禽N₂O與甲烷的排放。本試驗結(jié)果表明，添加NCG線性降低了甲烷的排放量。分析原因有以下兩點：一是添加NCG增加了瘤胃中丙酸的含量，利用了更多的H₂，從而減少了甲烷的生成；二是NCG能夠促進機體內(nèi)源精氨酸的生成，促進腸道發(fā)育，提高了胃腸道消化吸收的比例，影響腸道微生物的代謝物如甲NH₃-N甲胺等的產(chǎn)量，從而降低甲烷產(chǎn)量。

本試驗條件下，每頭動物添加15ｇ· d^-1NCG能有效調(diào)控荷斯坦奶公牛瘤胃發(fā)酵，15～25ｇ· d^-1均顯著降低甲烷排放量，推薦添加量為15ｇ· d^-1。